3种家兔破损皮肤模型中的制剂透过率对比

　　经皮给药制剂又称经皮给药系统（transdermaldrug delivery system,TDDS）或称透皮治疗系统（transdermal therapeutic system,TTS），是药物通过皮肤吸收后转运至局部组织或全身血液循环而发生局部或全身作用的制剂[1].此类制剂的安全性评价常因其剂型、给药途径等特殊性而有一定难度，主要因为经皮给药后的实际剂量及毒性暴露量和毒性反应程度取决于透入皮肤的药量，而临床上皮肤病变往往改变了正常皮肤屏障完整性和药物通透性，药物的透皮吸收率除了受药物本身理化特性、给药方法等因素限制外，还常因皮肤屏障功能状态受到不同程度的影响[2-3],因此，在刺激性和长期毒性试验中通常需将破损皮肤模型用于试验，以充分暴露受试物的局部刺激性或/和全身毒性。

　　目前，国内通常采用体外扩散池法、残留量分析法和在体微透析法等方法进行经皮给药制剂的透过率或药动学方面的研究[4-5];安全性评价实验室常用的破损皮肤制备方法有针头划伤、砂纸打磨、钝器刮伤或由脱毛剂造成的表皮损伤[6].但动物破损皮肤与人临床不同疾病下皮肤的角质层状态并不完全一致，并且实验操作者在选择上述制备方法时通常考虑的多是操作的方便程度，往往凭经验以肉眼判断破损程度，忽视了脱毛过程所致角质层损失差异和皮肤破损模型制备方法及其他因素对实际的病理损伤程度及药物透过率产生的影响，从而可能对经皮给药制剂的毒性评价带来不同程度的干扰。

　　本文以草乌甲素凝胶膏为受试物，选用针头划伤、砂纸打磨、4% Na2S 脱毛剂处理这 3 种有代表性的皮肤破损方法制备家兔破损皮肤，以体外扩散池法开展体外透皮实验，考察上述方式所得破损皮肤的体外吸收特征，并从破损皮肤的组织病理学形态和药物皮肤体外渗透速率这两个方面探讨不同破损皮肤模型制备方法及因素产生的差异及影响，为经皮给药制剂毒性暴露和安全性评价选择更为科学合理的病理模型提供实用的技术方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 仪器

　　Agilent 1200SL 液相色谱仪（Agilent,二元泵，自动进样器）；API 3200 Q-Trap 三重四级杆串联质谱（美国 AB 公司）；Analyst 1.5 工作站；智能透皮试验仪（天津富兰斯 YB-P6）；分析天平（美国 Ohaus公司）；Allegra 64R 高速冷冻台式离心机（美国Backman 公司）；XW-80A 涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；MD200 氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）；宠物用电推剪（上海 CODOS KP-3000）；组织病理学检查仪器均为德国 Leica 公司。

　　1.2 试药

　　草乌甲素凝胶膏（载药量约为 0.06 mg/cm,云南省药物研究所，批号 201307）；草乌甲素对照品（质量分数≥98%,中国食品药品检定研究院，批号100530-200501）；次乌头碱（质量分数≥98%,北京世纪奥科生物技术有限公司，批号 MUST-13011706）；甲醇（色谱纯，德国 Merck 公司）；其余试剂均为分析纯。

　　1.3 动物

　　普通级日本大耳白家兔 6 只，雌雄各半，3~4月龄，2.4~3.0 kg,来源于昆明市艾尼莫实验动物养殖中心，许可证号：SCXK（滇）K2012-0002.

　　1.4 LC-MS/MS 检测条件

　　1.4.1 色谱条件 色谱柱为 Agilent ponoshellSB-C18柱（50 mm×4.6 mm,2.7 μm）；流动相为0.1%甲酸 10 mmol/L 醋酸铵水溶液-甲醇（12∶88）；体积流量 0.5 mL/min;柱温 20 ℃；进样量 5 μL.

　　1.4.2 质谱条件 ESI 源，POS 模式，MRM 定量。

　　草乌甲素 [M+H]+1[M+H]+为 m/z 616.3→556.2.质谱参数：CUR 10.0,IS 5500.0,TEM 300.00,GS1 25.00,GS2 35.00,iheON,CAD LOW,DP 72.0,EP 10.00.

　　1.5 检测样本预处理

　　精密加入 10 μL 内标工作液至 2 mL EP 管中，氮吹至干，再精密移取 100 μL 经扩散池收取的 PBS溶液，旋涡 2 min,加入 1 mL 醋酸乙酯，涡旋 3 min,4 000 r/min 离心 10 min,取上清 600 μL,氮气吹干，200 μL 甲醇复溶，15 000 r/min 离心 10 min,取上清，5 μL 进样。

　　1.6 离体破损皮肤制备

　　破损皮肤的破损程度参照 2014 年 5 月 13 日颁布的《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》的附录中有关“3. 皮肤刺激性试验”对破损皮肤破损程度的描述，即“破损皮肤试验中皮肤破损程度以损伤表皮层为限”[7],故本实验中选择了3 种有代表性的制备方法来获得破损皮肤，并结合组织病理学检查结果综合判断，确定皮肤的最适破损程度。

　　1.6.1 破损方法 家兔乙醚麻醉后，用宠物电推剪先将背部毛尽量剔除干净，剔除过程中注意勿将兔皮肤划伤。将 6 只去毛后的家兔分为 3 个组，每组2 只。按下面 3 种方式制备破损皮肤。

　　A 法：针头划 即用 5 mL 一次性注射器针头在家兔皮肤表面间隔 3 mm 划多条横线，再间隔 3mm 划多条竖线，形成多个“井”字，深度以皮肤表面变浅红即可。

　　B 法：砂纸打磨 即将砂纸包裹在木棒上，然后在家兔皮肤表面轻轻摩擦，直至皮肤表面变为浅红。

　　C 法：化学脱毛剂 即将纱布浸于 4% Na2S 中，再将纱布敷于家兔皮肤 5 min 后取下，以洁净纱布擦净皮肤表面残余Na2S,再用大量清水冲洗至 Na2S除净。

　　1.6.2 离体破损皮肤制备 6 只家兔分为 3 组，按上述 3 种方法破损皮肤后及时颈总动脉放血安乐死，剖取上述 3 种方法制备的破损皮肤各约 6×6cm2,除去皮下组织和脂肪，以生理盐水冲洗适当时间，每种方法所获的每块破损皮肤均分为两部分，其中一部分皮肤置福尔马林溶液中固定，用于组织病理学检查，以确定皮肤破损程度是否适宜，另外一部分皮肤则用于体外透皮实验。

　　1.7 破损皮肤病理学检查

　　病理取材厚度 2~3 mm,长度约 1~2 cm,切片厚度 3 μm,HE 染色、制片，进行组织病理学镜检，据镜检结果对各块破损皮肤所见病变程度进行半定量分级。

　　1.8 家兔破损皮肤体外透皮试验

　　取草乌甲素凝胶膏，按扩散池接收口内径大小（1.17 cm2）将凝胶膏剪切，待用。将按“1.6”要求制备的离体破损皮肤固定于改良 Franz 扩散池上，皮内层面向下（朝向扩散池内方），皮外层面向上，将剪好的草乌甲素凝胶膏揭去保护层，紧贴于皮肤外层，用夹子将扩散池组合夹紧固定。扩散池接收室事先放入磁力搅拌子，并加满 32 ℃的 0.05mol/L、pH 7.4 PBS 溶液作为接收介质（12 mL），排出接收室中的气泡，使家兔皮肤内层与接收介质紧密接触，池外以 32 ℃水浴保温，磁力搅拌子以350 r/min 的速度搅拌，分别于 1、2、3、4、5、6、7、8、10、11 和 24 h 从接收池中抽取 0.3 mL 的 PBS接受液，同时向接收池中补充等量 32 ℃的 0.05mol/L、pH 7.4 的 PBS 溶液。将收集的 PBS 接收液置于 2~8 ℃备存，待所有时间点 PBS 接收液均收集后，分别按“1.5”项下方法处理、分析检测。

　　1.9 数据处理

　　通过各时间点样品测定结果，计算每个时间点单位面积的累积释药量（Q），并对结果进行评价。

　　Q=（PnV+V0-=11niip ）/A10为每次取样的体积，Pn为第 n 次所取样品测定的药物浓度，pi为第 i 个样品的药物浓度测定值，A 为扩散池中家兔皮肤的有效扩散面积。

　　2 结果

　　2.1 特异性

　　在本实验 LC-MS/MS 检测条件下草乌甲素及内标次乌头碱峰形均良好，在各自检测通道内未见干扰峰，两者保留时间分别为 1.21 min 和 1.19 min,结果见图 1.
　　
　　2.2 基质效应

　　本实验考察了空白 PBS 溶液经提取后，内源性杂质对草乌甲素和内标次乌头碱的离子抑制情况。

　　结果显示，草乌甲素 PBS 溶液质控样品在 1.987、31.80、509.0 ng/mL 这 3 个质量浓度下的基质效应（n=6）分别为 96.49%、94.92%、97.28%;内标次乌头碱基质效应（n=18）为 93.27%.

　　2.3 标准曲线和线性范围

　　以草乌甲素PBS溶液质量浓度C（分别为0.1242、0.496 7、1.987、7.950、31.80、127.0、509.0 ng/mL）为横坐标，草乌甲素峰面积（Ab）和内标峰面积（Ah）比值为纵坐标 Y,做线性回归，得回归方程为：Y=0.018 9C-0.002 57（r=0.992 8），权重系数 w=1/C2,药物浓度与峰面积间线性关系良好，线性范围为 0.124 2~509.0 ng/mL,最低定量限为 0.124 2ng/mL（S/N≥10）。

　　2.4 精密度和准确度

　　制备质量浓度分别为 1.987、31.80、509.0 ng/mL的草乌甲素 PBS 溶液质控样品，按“1.5”项下操作，重复 3 d,据随行的标准曲线计算测定浓度，由实测浓度计算批内与批间精密度，每批实测浓度的平均值与理论浓度的比值为准确度，结果见表 1.

　　2.5 回收率

　　制备质量浓度分别为 1.987、31.80、509.0 ng/mL的草乌甲素 PBS 溶液质控样品，按“1.5”项下操作，测定得峰面积为 A;精密移取 100 μL 空白 PBS溶液按“2.2”项下操作提取后得到的含基质残渣，用浓度分别为 1.987、31.80、509.0 ng/mL 的草乌甲素工作液复溶，测定得峰面积 B.A 和 B 的百分比即为提取回收率，结果见表 1.【1】

　　2.6 稳定性

　　制备浓度分别为 1.987、31.80、509.0 ng/mL 的草乌甲素 PBS 溶液质控样品，考察 PBS 溶液样品于 32 ℃放置 3 d、2~8 ℃存放 24 h、于 32 ℃放置3 d 后再于 2~8 ℃存放 2 d 的稳定性；同时考察按“1.5”项下操作处理后样品在室温及 2~8 ℃放置 3d 内多个时间点的稳定性。以随行的标准曲线计算测定浓度与理论浓度比较，变化范围在？1.33%~?11.89%,表明在上述条件下草乌甲素稳定性良好。