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孟鲁司特对肠缺血再灌注大鼠的肠黏膜细胞凋亡及相关蛋白表达

来源:UC论文网2015-11-05 11:04

摘要:

肠黏膜上皮稳定的维持,依赖于上皮细胞增殖与凋亡之间的平衡。半胱氨酰白三 论文网 烯/半胱氨酰白三烯受体 1( cysteinyl leukotrienes/cysteinyl leukotrienes receptor 1,CysLTs / CysLTsR1) 途径与肠缺

  肠黏膜上皮稳定的维持,依赖于上皮细胞增殖与凋亡之间的平衡。半胱氨酰白三论文网烯/半胱氨酰白三烯受体 1( cysteinyl leukotrienes/cysteinyl leukotrienes receptor 1,CysLTs / CysLTsR1) 途径与肠缺血再灌注( intestinal ischemia - reperfusion,I /R) 肠黏膜损伤有一定关系。孟鲁司特是特异性CysLTsR1 拮抗剂,跟 CysLTsR1 有高度亲和性和选择性,能有效抑制 CysLTs 与 CysLTsR1 的结合,减轻肠I /R 大鼠肠黏膜损伤[1]。孟鲁司特是否通过抑制肠黏膜细胞凋亡,从而对肠 I/R 起到保护作用尚未见文献报道。为此本实验用肠 I/R 大鼠动物模型,研究孟鲁斯特对 I/R 大鼠肠黏膜细胞凋亡和 CysLTsR1、caspase 8 和 caspase 9 的表达的影响,探讨孟鲁司特对肠 I/R 损伤的保护机制。

  材料和方法

  1 材料

  动物 Wistar 大鼠24 只,雄性,体重( 320 ±300)g,购自中国人民解放论文网军军事医学科学院实验动物中心。合格证号: SCXK -( 军) 2007 -004。药品与试剂 孟鲁司特( 商品名: 顺尔宁) ,规格:每粒4 mg,批号:110705,杭州默沙东制药有限公司生产。末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记测定法( TUNEL) 细胞凋亡原位检测试剂盒,由南京凯基生物科技发展有限公司提供; CysLTsR1、caspase 9和 caspase 8 抗体,购至美国 Abcan 公司。仪器 NC 膜,购自美国 Millipore 公司; TP -214电子天平,丹弗仪器( 北京) 有限公司产品; BH2 显微镜,日本OLYMPUS 公司产品; PS -9 电转仪,大连竞迈科技有限公司产品;MK3 酶标仪,芬兰雷勃公司产品。

  2 分组与给药

  随机将24 只大鼠分为 3 组: 假手术组、模型组及实验组,每组均8 只。术前禁食12 h,不论文网禁水。术前1 h,实验组灌胃孟鲁司特2 mg·kg- 1,假手术组和模型组给予等体积0. 9% 氯化钠。

  3 肠缺血再灌注模型的建立与取样

  大鼠腹腔内注射10%水合氯醛( 3 mL·kg- 1) 麻醉。仰卧位固定,消毒,上腹部沿正中线切一个长4 ~6 cm 的切口,暴露肠系膜前动脉,距其根部约 0. 5 ~0. 8 cm,游离约 0. 4 ~ 0. 6 cm 肠系膜前动脉。记时 45min 后,松开肠系膜前动脉夹。在进行肠系膜前动脉夹闭期间,间断地向腹腔内注射约 0.9% 氯化钠15 ~ 20 mL·kg- 1。关论文网腹后,再向腹腔内追加 0. 9%氯化钠25 ~30 mL·kg- 1( 含5 万单位青霉素钠) 。术毕放回鼠笼,饲养观察,自由进食、饮水。再灌注90 min 后,处死大鼠。取距离盲肠 10 ~20 cm 处,剪取末端回肠组织,用于检测。

  4 观察指标和方法

  4. 1 小肠含水量测定取部分小肠标本,称量小肠湿重,置 90 ℃电热干燥箱内烘烤72 h,称干重。小肠含水量为小肠组织湿重和小肠组织干重的差值与小肠组织湿重的百分比。

  4. 2 肠黏膜上皮细胞凋亡的检测按照 TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒说明书进行。在显微镜下,观察阳性细胞呈棕褐色。400 倍镜下,在每个组织块选择 3 个阳性视野,计数 200 个细胞中阳性细胞数,作为凋亡指数,任意选择 3 个视野,求其平均值。

  4. 3 Western blot 检测大鼠肠 CysLTsR1、caspase 8和 caspase 9 的表达

  将组织剪成细小的碎片,每 20 mg 组织加入裂解液150 ~ 250 μL,匀浆至完全裂解。样品于 4 ℃ 、1. 2 × 104g离心 15 min,取上清,进行蛋白质定量。取所需蛋白,加入适量上样缓冲液,沸水浴10 min 后,离心取上清上样。将配制好的 PAGE 胶放入电泳槽中,加入适量电泳缓冲液电泳,分离蛋白,当染料到达胶底部时,停止电泳,进行下一步转膜。用5%脱脂奶粉室温封闭1 h 或 4 ℃过夜。根据 CysLTsR1( 1∶500) 、GAPDH( 1∶ 1500) 、Caspase 8( 1∶ 500) 和 caspase 9( 1∶500) 稀释抗体,抗体加入封闭液中,稀释到所需浓度,和膜室温孵育2 h 或4 ℃孵育过夜。按照 1∶1000 稀释 HRP 标记的二抗,与膜37 ℃孵育1 h,再与中国论文网 ECL 发光液 A 和 B 等量混匀,避光5 min 后,曝光、显影和定影,对结果进行吸光度扫描分析。

  5 统计学

  处理用 SPSS13.0 进行统计分析,计量资料以 x珋± s 表示,组间比较采用单因素方差论文网分析,组内比较采用配对样本 t 检验。

  结 果

  1 孟鲁司特对小肠 I /R 后小肠含水量的影响与假手术组比,模型知网论文检测组大鼠小肠含水量显著增加,差异有统计学意义( P <0.05) 。实验组小肠含水量均显著低于模型组,差异有统计学意义( P<0.05) ,见表1。

  2 肠黏膜组织凋亡的改变缺血再灌注可引起肠细胞凋亡显著升高,实验组可显著减少缺血再灌注引起的细胞凋亡,与模型组比较差异有统计学意义( P <0.01) ,见表2。显微镜下观察,模型组,肠黏膜变短,棕褐色细胞数增多。实验组,肠黏膜较模型组长,可见较多的棕褐色细胞。

  3 比较 3 组的肠组织 CysLTsR1、caspase 9 和caspase 8 蛋白的表达肠组 织 CysLTR1 表 达 模 型 组,肠 组 织CysLTR1表达为( 80. 32 ± 6. 24 ) % ,较假手术组的( 24. 19 ±5. 61) % 明显增加( P < 0. 05) 。实验组为(61.75 ±5.21) %,与模型组的( 80.32 ±6.24) %比较,实验组可显著降低CysLTR1 表达( P < 0.05) 。肠组织 caspase 9 和 caspase 8 的表达 模型组,肠组织 caspase 9 表达为( 166.10 ±10.68) %,较假手术组的( 44.19 ±7.82) % 明显增加( P <0.05) ; 实验组 caspase 9 表达为( 107.34 ±9.98) %,与模型组的( 166.1 ±10.68) %比较差异有统计学意义。模型组,caspase 8 表达为 ( 52. 00 ± 5. 69 ) % ,与假手术组的( 30.14 ± 6.12) % 明显增加( P < 0.05) ; 实验组为( 29.85 ±6.83) %,较模型组显著降低,差异有统计学意义( P <0.05) 。本结果提示,孟鲁司特可显著降低caspase 9 和 caspase 8 表达。

  4 小肠黏膜细胞凋亡指数与小肠含水量关系相关分析表明,小肠含水量与小肠黏膜细胞凋亡指数呈正相关( r =0. 7846,P <0.01) ,说明小肠凋亡指数越低,小肠含水量越低。

  讨 论

  肠 I/R 是出血性休克、严重烧伤创伤、器官移植、肠系膜血管栓塞和外科急危重病知网论文检测等临床常见的病理生理过程,病死率较高,是小肠移植的最大障碍。CysLTs / CysLTR1 作用广泛,在多个器官的 I /R 损伤中均起着重要作用[6 -9]。而孟鲁司特对肝、肠和脊髓I /R 引起的损伤有保护作用[1,9 -10]。

  本研究结果显示,大鼠的正常肠组织中有CysLTR1的弱表达,肠 I /R 可显著增加大鼠肠组织中CysLTR1的表达,肠黏膜细胞凋亡指数升高,小肠含水量明显增加; 而给予孟鲁司特后,CysLTR1 的表达减弱,肠黏膜上皮细胞凋亡指数降低,小肠含水量减少,从而表明 CysLTR1 参与了肠 I/R 肠损伤的发生。进一步相关分析表明,小肠含水量与肠黏膜凋亡指数呈正相关,证实肠黏膜细胞凋亡指数的升高,可增加肠壁的通透性。抑制肠黏膜细胞凋亡,是孟鲁司特保护肠 I/R 损伤的重要机制。本研究结果发现,肠 I/R 时,肠黏膜细胞凋亡增加,同时伴有 caspase 8 和 caspase 9 均明显升高,提示caspase 8 和 caspase 9 参与了肠 I /R 引起的肠黏膜细胞凋亡途径。Caspase 级联依赖的细胞凋亡主要是通过两条途径引发的: 由死亡受体激发的外源性途径和线粒体激发的内源性途径,caspase 8 和caspase 9 的激活分别是外源性凋亡途径和内源性途径的凋亡启动因子,通过级联反应,两条途径最终通过激活caspase 3引起细胞凋亡。孟鲁司特可抑制 caspase 3 的活性,减少细胞凋亡。

  本研究结果显示,孟鲁司特可同时降低 caspase 8和 caspase 9 的表达。提示肠 I/R 通过激活外源性途径和内源性途径引起肠黏膜细胞凋亡,而孟鲁司特通过抑制上述两种途径,减少肠黏膜细胞凋亡。表明孟鲁司特可以减少肠 I/R 肠黏膜细胞的凋亡,抑制 caspase 8 和 caspase 9 的表达是其重要的凋亡机制。

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